Ingenieria de Procesos aplicada a la Biotecnología de Microalgas
1.3 - Nutrientes y medios de cultivo de microalgas
Las microalgas requieren para su crecimiento, como ya se ha dicho, agua, luz, CO2, y sales minerales entre las que se encuentran principalmente alguna fuente de nitrógeno como nitrato o amonio y una fuente de fosforo que suele ser algún fosfato inorgánico. Los requerimientos de otras especies, como calcio, manesio, cloruro, sodio ... etc u oligoelementos como cobre, cobalto o manganeso, varian ampliamente entre especies. Afortunadamente existe mucha información fácilmente accesible al respecto.
Medio de cultivo
El medio de cultivo es una disolución acuosa que transporta los nutrientes inorgánicos que necesitan las microalgas para su crecimiento. El suministro de medio de cultivo y las concentraciones de los nutrientes deben estar acoplado con la producción de biomasa de forma que se suministren en cantidad suficiente para que nunca se produzca una limitación que tendría como consecuencia una disminución en la productividad de biomasa o incluso alguna disfución del cultivo como la fotoinhibición.
Los principales nutrientes necesarios son:
- Agua: además de transporte, es un nutriente que suministra los electrones (H·) necesarios para la reducción del CO2.
- Carbono: normalmente suministrado aparte como CO2, aunque puede suministrarse como bicarbonato, considerablemente más caro.
- Oxígeno: suministrado tanto por el H2O como por el CO2. Sin embargo es sólo el oxígeno del CO2 el que se incorpora en la biomasa.
- Nitrógeno: el cuarto elemento más importante por volumen ya que forma parte de las proteínas y nucleótidos de la biomasa. Suministrado como NO3- o NH4+.
- Fósforo: suministrado como fosfato, forma parte de importantes intemedios metabólicos, lípidos, enzimas y multitud de especies bioquímicas.
Adicionalmente existe una gran cantidad de otros nutrientes que pueden ser necesarios dependiendo de la especie. Según la cantidad en la que se necesiten se suelen clasificar como macronutrientes o micronutientes, ya que es importante para la preparación del medio.
- Macronutrientes: sales como clouro de sodio y magnesio, sulfatos y sales de calcio. Pueden aparecer en concentraciones de hasta 30 g/L cuando se trata de especies marinas y hasta de 100 g/L en microalgas halófilas. Estos macronurientes no se consumen en la generación de biomasa o se incorporan en muy pequeña medida. Su omjetivo principal es mastenes la presión osmótica y el equilibrio de electrolitros.
- Micronutrientes: Son elementos que actuan como cofactores de enzimas y aparecen en muy pequeñas cantidades, a veces de microgramos por litro. Si se ponen en exceso pueden actuar como un veneno, como es el caso del cobre, que es un conocido alguicida.
A continuación vemos los principales nutrientes y estudiamos su función en la biomasa y los aspectos más relevantes de su asimilación.
HIDRÓGENO
El hidrógeno es una gran parte de la materia viva en general y de la biomasa microalgal en particular, especialmente si se mide en base molar.
El origen de la mayor parte del hidrógeno presente en la biomasa es el agua. Ésta es la fuente de electrones que permiten reducir el NADP+ a NADPH creando poder reductor para ser usado posteriormente en el ciclo de Calvin.
La rotura del agua tiene lugar en el fotosistema II y la reacción da como subproducto el oxígeno molecula que liberan al aire todas las plantas, algas y microalgas.
Es muy importante que nunca falte agua para que no se detenga el PSII. Sin embargo, puesto que el agua es una parte tan importante del medio de cultivo (es una disolución acuosa), en la práctica nunca se agota y podemos despreocuparnos del agua.
Nutrientes y su función
CARBONO
Ls microalgas fotoautotróficas, por definición, tienen como única fuente de carbono al CO2. El CO2 puede estar en el medio como alguna sal derivada, tal como carbonato o bicarbonato, pero su reducción e incorporación a la biomasa en el ciclo de Calvin siempre se produce teniendo como sustrato al CO2 molecular.
El carbono constituye aproximadamente un 50% de la biomasa en peso medido en base seca libre de cenizas.
El CO2 es condensado con la ribulosa 1,5 bifosfato, un azúcar de 5 carbonos activada con grupos fosfato. El producto de la reacción son dos moléculas de fosfoglicerato, por lo que el resultado neto de la reacción es que se tiene un carbono orgranico más (pasamos de 5 carbonos orgñanicos en la ribulos 1,5 bifosfato a seis en las dos moléculas de fosfoglicerato).
Esta reacción es catalizada por un enzima llamado RuBisCO (ribulosa 1,5 bifosfato carboxilasa) que es la que condensa la ribulosa con el dioxido de carbono. Esta enzima es probablemente la más abundante sobre la corteza terrestre y es literalmente la que produce todos los alimentos que sostienen a animales, bacterias, hongos ...etc; es decir, a todos los seres vivos.
Es util señalar que la RUBISCO ademas de ser una carboxilasa es además una oxigenasa. Es decir, que también cataliza la adición de oxígeno a la RuBis produciendo unos intermedios metabólicos bastante inútiles e indeseables, en algo qu epuede considerarse un cortocircuito de la fonosíntesis denominado FOTORRESPIRACIÓN.
Esta reacción es lenta en la naturaleza, ya que la afinidad de la RuBisCO por el CO2 es mucho más alta que por el O2. Sin embargo, en fotobiorreactores la actividad fotosntética es intensiva y el elevado consumo de CO2 acompañado por una alta generación de O2 pueden provocar el agotamiento del primero y la sobresaturación del segundo. En estas circunstancias la fotorrespiración se hace importante y se produce una impotante pérdida de productividad.
Por tanto, es necesario mantener siempre un suministo de CO2 suficiente, bien acoplado a la generación de biomasa pero sin gran exceso para evitar pérdidas antieconómicas, y evacuar eficientemente el O2 generado de manera que se mantenga la menor concentración posible.
RUBISCO
Rotura del agua el el PSII
Reducción del CO2 en el ciclo de Calvin.
NITROGENO
El nitrógeno constituye una parte relativamente importante de la biomasa, aproximadamente el 5% (masa sobre peso seco), ya que entra en la composición de proteínas y nucleótidos.
Las principales fuentes de nitrógeno son:
- Nitrato (NO3-) : es, en general, la forma mejor absorbida, pese a que en esta especie el nitrógeno está muy oxidado (+5) y debe ser reducido hasta el estado de oxidación del grupo amino (-NH2) que es como se encuentra en las proteinas (-3). Esto consume una gran cantidad de poder reductor (NADPH) y eleva el pH al consumir H+. El nitrato, normalmente suministrado como nitrato sódico, es bien tolerado en concentraciones muy altas, del orden de varios gramos por litro, si bien en base molar el contenido en nitrógeno es relativamente bajo.
- Amonio (NH4+) : el amonio también es absorbido por muchas especies como fuente de nitrógeno aunque resulta ligéramente tóxico para otras. En general se acepta que es bien tolerado en concentraciones de hasta 50 mg/L, aunque algunas especies aguantan concentraciones sustancialmente más altas. El amonio como nutriente tiene gran importancia en el tratamiento de aguas residuales.
- Aminoácidos y urea : son otras fuentes potenciales con un estado de reducción favorable (-3) aunque son poco usados y no presentan ventajas significativas y sí un coste sustancialmente más elevado.
- Nitrógeno molecular (N2) : Algunas cianobacterias, como Anabaena, son capaces de fijar el nitrógeno de la atmósfera gracias a una células especiales denominadas heterocistos. A la derecha puede ver un filamento de Anabaena con un heterocisto en el centro. Estas cianobacterias tiene nla ventaja de no necesitar nitrógeno en el medio ya que lo cogen de la atmósfera. Al carecer de N en el medio, los cultivos son resistentes a invasiones aunque su crecimiento es lento.
OXÍGENO
El caso del oxígeno es trivial.
Aunque es una parte muy importante de la biomasa, está presente tanto en el agua como en el CO2, por lo que no es necesario suministrarlo de otra manera. De hecho tanto el CO2 como el agua contienen más oxígeno queE carbono e hidrógeno respectivamente. l oxígeno que se incorpora a la biomasa es el que de la molécula de CO2. El que se libera como O2 es el de la molécula de agua.
FÓSFORO
El fósforo aparece en importantes intermedios metabólicos y en moléculas estructurales como los fosfolípidos.
El fósforo es suministrado como fosfato o fosfatos ácidos (PO4-3, HPO4-2, ... ) que a menudo son bastante insolubles en presencia de otros iones del medio (como el Ca+2), por lo que es importante seguir las instrucciones de preparación del medio para que no precipite.
CLORURO, SODIO, POTASIO, CALCIO, MAGNESIO, SULFATO (AZUFRE)
Son iones que aparecen en los medios en gran cantidad, aunque a veces no se consuman. Son importantes para mantener la presión osmótica y el equilibrio iónico.
Aparecen en gran cantidad en el agua de mar (microalgas marinas) ya sea natural o agua de mar sintética.
Algunos son, no obstante, importantes componentes de la biomasa. El magnesio es el ión central que aparece en el núcleo de porfirina de la clorofilas
MICRONUTRIENTES: manganeso, cobre, cobalto, zinc, molibdeno, vanadio y otros
Aparecen en muy pequeña cantidad y no deben ser añadidos en exceso. Son cofactores de enzimas y por tanto imprescindibles para algunas especies de microalgas. A veces se encuetran algunas vitaminas entre los micronutrientes necesarios.
Preparación de medios de cultivo
Existe una amplia información sobre medios de cultivo tanto en la bibliografía como, más recientemente, on-line en los sites de las colecciones. Encontrar un medio de cultivo adecuado a una microalga es, pues, una tarea relativamente fácil siempre que la especie esté identificada: basta buscar la especie o una lo más cercana posible y podremos encontrar uno o más medios adecuados.
Debajo se muestra la "receta" del medio f/2 tal y como aparece en la página web de la UTEX (colección de la Universidad de Texas, USA). Lo llamo receta porque además de los componentes, aparece descrita la forma de preparación:
Como puede ver, el medio está compuesto por dos conjuntos de sustancias unos en mayor concentración listados a la izquierda (aunque es un medio bastante diluido, dicho sea de paso)
Rendimiento estimado y cálculo de necesidades de nutrientes
Conociendo la composición de la biomasa y el contenido en nutrientes de un medio, es posible calcular la concentración de biomasa que se puede obtener de una determinada fórmula.
De forma similar, si se dese alcanzar una concentarción final de biomasa determinada, es posible calcular la concentarción de nutrientes necesaria que habría que poner inicialmente o, si estamos trabajando en continuo, la productividad deseada permite calcular la tasa de entrada necesaria (caudal de medio por concentración de nutriente).
El proceso es sencillo:
- Se detemina cual es el nutriente limitante en el medio. En la mayoría de los casos es el nitrógeno.
- Se calcula el contenido en notriente limitante del medio utilizando la concentración de éste y la estqueimetría del compuesto.
- Usando la composición de la biomasa, se establece una proporción que nos da la concentración de biomasa que conendrá ese nitrógeno una vez metabolizado.
- O, viceversa, para una concentración de biomasa esperada, se calcula la concentración de N que necesitaría en el medio y con la estequiometría de las sal se calcula la concentración necesaria de nutriente.
Hagamos algunos ejemplos resolviendo las siguientes cuestiones (debajo). Supongamos que la biomasa contiene un 5% en peso de N en todos los casos y que el N es el nutriente limitante.
Cuestiones
1 - ¿Qué concentración de biomasa cabe esperar de un cultivo que incialmente contiene 1 g/Lde NaNO3? ¿Y si se usase 1 g/L de NH4Cl?
2 - ¿Que concetración de KNO3 inicial es necesaria para obtener una concentración final de 1,2 g/L de biomasa?.
3 - ¿Que cantidad de CO2 habría consumido el cultivo de la cuestión 3? (suponga un 50% de C en peso en la biomasa).
4 - Un fotobiorreactor de 2000 L se encuentra operando en continuo en estado estacionario con D=0,25 1/h y Cb= 1,1 g/L ¿qué concentración de NaNO3 mínima debe tener el medio fresco?
5- ¿Qué caudal de CO2 en cn consumirá el anterior fotobiorreactor de la cuestión 5?
6.- Si la biomasa de la cuestión 3 tiene un 0,5% de P, ¿Que concentración mínima inicial de K2PO4H sería necesaria?
1.3 - Nutrientes y medios de cultivo de microalgas
Tanques de preparación de medio en una instalación a escala de planta piloto.
Los recipienstes son más grandes, pero los problemas son similares: evitar que precipiten iones que puedan pormar sales insolubles.
En este caso se pueden preparar hasta 4 stocks (disoluciones concentradas) por separado, que se mezclan con agua (dulce o marina) diluyendose justo antes de ser introducidos a los FBRs.
Al fondo se ven la cedena de filtros esterilizantes que es el método más habitual en estas instalaciones usado para mantener los cultivos axénicos.