1 - Fundamentos de los procesos basados en microalgas.

1.3 - Fundamentos del cultivo de microalgas

Vamos a enumerar los elementos que se necesitan para llevas a cabo un cultivo de microalgas. Esta asignatura está enfocada en el cultivo de microalgas a escala industrial, pero lo que se expone en este apartado es válido para cualquier escala, desde laboratorio a planta piloto a producción industrial.

Los elementos necesarios son.

• Inóculo
• Medio de cultivo
• Iluminación
• Termostatación
• Agitación y mezcla
• Intercambio de gases ($O_2$ y $CO_2$)
• Mantenimiento del pH
• Fotobiorreactor

El objetivo de este apartado es que, después de estudiarlo, sea vd. capaz de realizar un cultivo de microalgas/cianobacterias de forma efectiva.

- Inóculo

Un inóculo es una pequeña cantidad de caldo de cultivo conteniendo el microorganismo que se desea reproducir y está en condiciones de iniciar un nuevo cultivo alguno órdenes de veces mayores que el volumen de inóculo.

Por motivos de conservación, los inóculos pueden guardarse en placas Petri con medio en agar o tubos de ensayo con slant de agar. Estos cultivos en medio sólido deben ser pasados a medio líquido antes de poder ser usados en cultivos útiles a escala de laboratorio o escala industrial.

Los inúculos de microalgas son particulares en el sentido de que necesitan mantenerse iluminados para que el microorganismo sobreviva.

Una alícuota de inóculo se utiliza para escalar a cultivos cada vez mayores. En principio, el inóculo debería ser suficiente para proporcionar una densidad celular o concentración de unos 50 mg/L con el objeto de conseguir un cultivo robusto.

Obtención de inóculos

Los inóculos se pueden obtener de diversas formas:

1. Aislamiento de cepas: de muestras de mar, lagos, rios o cualquier masa de agua susceptible de contener estos microorganismos.
2. Pidiéndoselo a alguien. Mucha gente no tendrá problema de dejarle tomas una mustra de su cultivo.
3. Comprándolos en colecciones de microorganismos.

Las alternativas 1 y 2 dependen de su disposición, de su red de contactos y de su encanto personal. Sin embargo, puede comprar vd. inóculo de las cepas disponible en los así llamados "Bancos" o Colecciones" de microorganismos.

Colecciones de microorganismos

Hay tres entidades que yo puedo recomendarle:

• CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa) en Oban, Scotland, UK
• UTEX Culture Collection of Algae, Austin TX, USA
• BEA (Banco Español de Algas) en las Islas canarias, España

Puede acceder a cualquiera de estas colecciones a través de los sigueinte enlaces:

La siguiente imagen muestra la compra de Haematoccocus pluvialis en la UTEX.

Lo difícil es no seguir comprando.

- Medio de cultivo

De la ecuación de la fotosíntesis sabemos que las microalgas necesitan para crecer $CO_2$ y $H_2O$. Esta última es tanto un nutriente como parte del entorno, ya que las microalgas se desrrollan en medios acuosos. También hemos visto que las microalgas necesitan:

• Una fuente de nitrógeno $(N)$ en forma de alguna sal de nitrato $(NO_3^-)$ o amonio $(NH_4^+)$. También pueden ser utilizadas como fuente de nitrógeno aminoácidos o urea $(CO(NH_2)_2)$.

• Azufre, normalmente en forma de sulfato $(SO_4^=)$.

• Fósforo como fosfato $(PO_4^{-3})$

Además, es obvio que son necesarios los siguientes elementos:

• Magnesio $(Mg^{+2})$, componente esencial de las clorofilas (es el núcleo del anillo tetrapirrólico que qparece en todas las clorofilas) y cofactor de enzumas, entre otras funciones.

• Manganeso, componente central del complejo de evolución de oxígeno en el Fotosistema II y cofactor de la enzima superóxido dismutasa que previene el daño oxidativo, entre otras funciones.

• Iones como Calcio $(Ca^{+2})$, Sodio $(Na^+)$, Potasio $(K^+)$, o Cloruro $(Cl^-)$.

Todos estos son nutrientes aparecen en el medio de cultivo en cantidades relativamente grandes,por lo que son denominados macronutientes. Sin embargo, aparecen una gran cantidad de otros elementos en cantidades muy pequeñas que suelen ser denominados nutrientes minoritarios o nutrientes traza.

No obstante, aunque aparezcan en pequeñas cantidades, son imprescindibles para el crecimiento del microorganismo. Entre esto nutrientes, podeos mencionar:

• Hierro $Fe$
• Cobalto $Co$
• Zinc $Zn$
• Molibdeno $Mo$
• Cobre $Cu$
• Boro $B$
• Vitaminas (Biotina, Thiamina, Niacinamida, Cianocobalamina)

Y pueden aparecer algunos más. Esta lista no es exhaustiva.

Y pueden aparecer algunos más. Esta lista no es exhaustiva. Lo cierto es que conocer un medio completo para una microalgas no es fácil. Antes requería una investigación bibliográfica detallada. Sin embargo, con los recursos onlay disponibles hoy en día, basta con que 1) busque la cepa que desee cultivar en una colección, 2) identifique el medio recomendado y descargue la receta:

🔍 Buscar cepa

🧪 Identificar medio

📥 Descargar receta

Esto es un ejemplo de una búsqueda ya hecha. Pruebe vd a buscar medios para Haematococcus, Mycrocistis o Spirulina (Arthrospira), por sugerir alguna.

Los medios de cultivo que se encuentran en la bibliografía o en las colecciones son medios de mantenimiento, que le permitirán cultivar una y otra vez pequeños cultivos de laboratorio para caracterización de la cepa o uso como inóculos de sistemas más grandes.

Sin embargo, estos medios no son adecuados para producción. Observe la ocmposición final del medio B3N mostrado arriba. La concentración de nitrato sódico es de solo 8,83 milimoles/L. Esto corresponde aproximadamente a $C_{NaNO_3}≈$ 0,75 g/L que es igual a $C_{NaNO_3}≈$ 0,125 g/L de nitrógeno asimilable.

Si hacemos uso de la estqquiometría que aprendimos en el apartado anterior, sabemos que $\Psi_{\frac{N}{b}} = 0,5$. Por tanto:

$\large C_b=C_N/ \Psi_{\frac{N}{b}} = 0,125/0,05=2,5 g(biomasa)/L$

Por lo que la concentración de biomasa máxima estaría limitada a 2,5 g/L por el nitrógeno. Esto no es aceptable en un medio de producción ya que en fotobiorreactores a menudo llegamos a concentraciones mucho más altas. De esta forma, estos medios deben ser considerados como listados de nutriente esenciales y como proporciones ideales. Para medios de producción, las concentaciones de los nutrientes mayoritarios las determinaremos por medio de balances de materia aplicados al sustrato limitante.

- Iluminación

Las microalgas son microoganismos autótrofos, que obtienen su energía de la luz, como ya hemos comentado.

La luz es radiación electromagnética, que se emite y absorbe en forma de cuantos, por lo que podemos medir la cantidad de flujo que llega como densidad de flujo fotónico (en inglés PFD, photon flux density) y son comunes la unidades de $\large \frac{\mu\,\text{moles de fotones}}{\text{m}^2 \cdot \text{s}}$

La luz transporta energía. Esta energía depende de la longitud de onda o frecuencia de la onda asociada al foton. La energía de los fotones se suele dar como su longitud de onda en nanometros $(\lambda)$. Sin embargo, el cálculo no es inmediato. Para calcular la energía del fotón $(e)$, necesitamos usar la ecuación de Plank:

$$e = h \cdot \nu$$$$c = \lambda \cdot \nu$$$$h = 6{,}626 \times 10^{-34} \text{ (J·s)}$$

Donde:

• $e$ = energía del fotón $(J)$
• $h$ = constante de Planck (NO reducida, la reducida es $\hbar = h/2\pi$)
• $\nu$ = frecuencia (Hz, $\frac{1}{s}$)
• $c$ = velocidad de la luz $(\text{300.000.000 } \frac{m}{s})$
• $\lambda$ = longitud de onda (m)

Reorganizando estas ecuaciones, se puede obtener la siguiente expresión que da la energía del fotón en función de su longitud de onda $(\lambda)$

$$E_{\text{mol}} = \frac{1.196\cdot10^5}{\lambda (\text{nm})} (\text{kJ/mol})$$

RADIACIÓN PAR: Pues bien, todo este rollo para decirle que la radiacaión luminosa útil para la fotosíntesis son los fotones que tienen una energía entre $\lambda$ 400 y 700 nm. Esta es la conocida como "radiación PAR", del inglés "Photosynthetically Active Radiation"

Por tanto, no es ninguna sorpresa si denominamos a la densidad flujo fotónico fotsintético como PPFD (P+PFD). En realidad nosotros utilizaremos la letra $I$ por Irradiancia, que es el nombre físico de esta magnitud.

El siguiente componente permite calcular la energía del fotón en base a su longitud de onda en nanometros:

⚛️ Calculadora de Energía del Fotón

Longitud de onda (λ): 550 nm

Frecuencia (ν):

545.45 THz

Energía (J):

3.614 × 10^-19

Energía (eV):

2.26 eV

E mol (kJ/mol):

217.6

550 nm

Este dato nos interesa por dos motivos:

• Para poder convertir de unidades energéticas ($W/m^2$) a unidades cuánticas $(\text{moles de fotones/}m^2\cdot s)$

• Para poder evaluar el rendimiento energético de los FBRs (energía fijada / energía absorbida).

Los fotones de 700 nm (171.0 kJ/mol y más energía) pueden excitar al PSI (fotosistema I). Los fotones de 600 nm (176.0 kJ/mol y más energía) pueden excitar a ambos fotosistemas. Toda la energía del fotón por encima de estos límites inferiores, se pierde en disipación interna.

Fuentes de luz

Hay fuentes naturales y artificiales. Pero cualquiera de ellas tiene algo en común, no contienen una única longitud de onda, sino una mezcla de longitudes de onda entre 400 y 700 nm. Esta composición se denomina espectro:

• El espectro de una radiación es la distribución relativa del número de fotones entre las distintas longitudes de onda. A menudo, esta distribución viene dada en energía, no en número de fotones.

• El espectro es, por tanto una función $e(\lambda)$ que permite obtener la radiación luminosa a cada longitud de onda $(I_{\lambda})$ a partir de la irradiancia total par $I_o$ de esta forma: $(I_{\lambda}=I_o\cdot e(\lambda))$. La función de distribución, ha de estar normalizada: $\frac{\int_{\lambda_1}^{\lambda_2} e(\lambda) \, d\lambda}{\lambda_2 - \lambda_1} = 1$

Las siguientes imágenes muestran los espectros de diferentes fuentes de luz (entre 400 y 700 nm).

• Hay que tener cuidado porque, si se tienen medidas energéticas $(I_W)$, la luz con fotones de menos energía producirá más fotosíntesis ya que la misma energía va transportada por más fotones y es el flujo de fotones el que impulsa la fotosíntesis.

• Por ejemplo, 100 $W/m^2$ de luz "incancescente" producirán más fotosíntesis que 100 $W/m^2$ de luz "LED". (Otra cuestión es que la fuente incandescente es mucho menos eficiente que la LED, pero eso no lo discutimos aquí).

Por ejemplo, la misma energía con un espectro más rico en rojo lleva más fotones que un flujo rico en violeta. Eso se puede comprobar en este componente interactivo:

💡 Flujo Fotónico vs Flujo Energético

Calcular flujo fotónicoCalcular flujo energético

Densidad de flujo energético (I_W)

500 W/m²

Longitud de onda (λ)

550 nm

Densidad de flujo fotónico

2297.3

µmol/(m²·s)

Para λ = 550 nm

I_PPFD vs λ (I_W = 500 W/m²)

Nota: Con la misma densidad de flujo energético (W/m²), el flujo fotónico es mayor para longitudes de onda largas (rojo) que para cortas (azul), ya que los fotones rojos tienen menos energía individual.

• Se puede convertir de $I_W$ a $I_{fotones}$ conociendo la energía del fotón (como hemos comentado antes) pero cuando tratamos con fuentes con espectro continuo, necesitaremos calcular la energía MEDIA del fotón como $\bar{E}_{mol}=\frac{\int_{\lambda_1}^{\lambda_2} \frac{1.196\cdot10^5}{\lambda } · e(\lambda) \, d\lambda}{\lambda_2 - \lambda_1}$

Hay que medir siempre flujo fotónico, no energético. El flujo energético es confuso e indeterminado para la fotosíntesis. Basta con usar un sensor cuántico en vez de un sensor energético. Los sensores cuánticos PAR están ampliamente disponibles para medidas de organismos fotosintéticos.

SOL

La fuente de luz más importante para el cultivo de microalgas es la solar. Tiene todas las ventajas:

• Es gratis

• Esta ampliamente distribuida

• Se adapta perfectamente al cultivo de microalgas.

Sin embargo, también tiene algunas desventajas:

• Varía con la localización, la época del año y la hora del día.

• Añade una importante cantidad de calor (radiación INFRARROJA, que es algo más del 50% del espectro solar), calentando los cultivos.

• No se puede regular; no está disponible por la noche.

Algunas de estas deventajas no lo son, ya que el ciclo diel o circadiano a menudo es requerido por muchas microalgas y cianobacterias para su crecimiento.

Si lo desea, puede comprobar la densidad de flujo fotónico y el ángulo de incidencia en su localización con esta HERRAMIENTA .

- Termostatación

Como acabamos de comentar, la luz del sol transporta una gran cantidad de radiación térmica que acaba convertida en calor.

De hecho, una gran proporción de la radiación PAR (como un 90% e incluso más) también acaba convertida en calor por diversos motivos, por muy bien que esté diseñado el FBR.

La radiación solar puede transportar hasta 1000 $w/m^2$, lo que, sin termostatación, puede producir incrementos de temperatura de hasta 5-10ºC/h.

En estas circunstancias, sin termostatación, el FBR alcanzaría rápidamente temperaturas de más de 40ºC que son letales para la mayoría de las cepas de microalgas y cianobacteria que nos interesan.

No solo eso. Si los FBRs se calientan sin control, las condiciones ambientales se desvian de sus valores óptimos, lo que baja el rendimiento y hace inútiles los modelos de crecimiento. A continuación se muestran temperaturas óptimas y máximas de diversas cepas de microalgas y cianobacterias.

Tabla: Temperaturas óptimas y máximas de microalgas y cianobacterias (referencias al pie):

Tipo	Especie	Óptimo (°C)	Máximo (°C)
Microalga	Chlorella vulgaris	25–30	35–38
Microalga	Haematococcus pluvialis	20–25	28–30
Microalga	Dunaliella salina	22–35	38–40
Microalga	Nannochloropsis oculata	20–25	28–30
Microalga	Scenedesmus obliquus	25–30	35–37
Microalga	Phaeodactylum tricornutum	18–22	25–27
Cianobacteria	Arthrospira platensis	35–38	40–42
Cianobacteria	Synechocystis sp.	30–35	38–40
Cianobacteria	Microcystis aeruginosa	27–32	35–40
Cianobacteria	Anabaena cylindrica	25–30	35

Por tanto, a menudo resulta imprescindible operar con algún tipo de termostatación. Es común operar con un cambiador de calor instalado en alguna parte del FBR.

Para calcular el cambiador de calor, es necesario conocer los siguientes parámetros:

• W : Cantidad de calor que entra al FBR (watios=J/s)
• $T_{opt}$ : Temperatura óptima de la cepa microalgal. Esta temperatura será la temperatura de cultivo $T_{c}$
• $T_{R}$ : Temperatura del refigerante. Temperatura del fluído que se otilizará para refrigerar.

A partir de esta variables, se puede calcular el cambiador de calor. Sus dos variables principales son:

• A : Área de intercambio de calor $(m^2)$.

• $Q_R$ : Caudal de refrigerante necesario.

La operación con un cambiador de calor bien dimensionado permite operar con una temperatura estable cercana a la óptima.

El dimesionamiento de sistemas de termostatación se estudiará en el Tema 6.

- Agitación y mezcla (impulsión)

Las microalgas, como cualquier otro microorganismo, necesitan ser mezclados y agitados para promover la homogeneización, la distribución de nutrientes, el intercambio de calor y materia. Esto es cierto tanto en cultivos de laboratorio como en cultivos para la producción industrial.

Esto también evita que las microalgas se sedimenten, se adhieran a las paredes y provoquen ensuciamiento (fouling). Mover el cultivo no suele ser suficiente para evitar por completo el ensuciamiento, pero aun así es esencial.

La necesidad de propulsión del líquido es obvia en sistemas como los fotobiorreactores tubulares, que requieren propulsión para hacer circular el cultivo a través del circuito. A menudo se utilizan bombas centrífugas o dispositivos neumáticos (airlifts).

Los raceways también necesitan circulación. Las ruedas de paletas (paddlewheels) se utilizan comúnmente para el bombeo.

Los dispositivos como las columnas de burbujas o los fotobiorreactores verticales de placa plana no requieren bombeo. La mezcla y la transferencia de calor y materia se favorecen mediante el burbujeo.

Los dispositivos como las columnas de burbujas o los fotobiorreactores verticales planos no requieren el uso de dispositivos clásicos de bombeo. La mezcla y la transferencia de calor y materia se favorecen mediante el burbujeo.

En resumen, los métodos de impulsión, agitación y mezcla son los siguientes:

• Bombas (centrifugas principalmente, también peristálticas).

• Paddle wheels : para impulsar fluídos en canalas como los de los FBRs tipo raceway.

• Bombeo por "airlift", un método en el que se inyecta un gas (aire) en una columna de agua de forma que se hace circular por diferencia de densidades. Este metodo es muy adecuado para microalgas pero de aplicación limitada.

• el burbujeo no es un método de bombeo pero sí de agitación, mexcla y homogeneización

El diseño de estos dispositivos consiste en determinar el caudal de fluído que se ha de bombear (q, $m^3/h$), la pérdida de presión que se ha de vencer ($\Delta P$, Pa, a veces dada como diferencia de altura $\Delta h$, m, de ahí el nombre de "head loss") y calcular la potencia que requiere el impulsor ($W_m$, watios=J/s, o Hp).

Algunos de esos casos se estudiarán en el Tema 6.

- Resumen

Elementos necesarios para cultivo industrial:

1. Inóculo - pequeña cantidad de cultivo para iniciar uno mayor (~50 mg/L densidad inicial)
2. Medio de cultivo - nutrientes esenciales
3. Iluminación - fuente de energía
4. Termostatación - control de temperatura
5. Agitación y mezcla - homogeneización
6. Intercambio de gases (O₂ y CO₂)
7. Control de pH
8. Fotobiorreactor - contenedor del cultivo

Inóculo

• Se obtiene de: aislamiento, contactos, o colecciones (CCAP, UTEX, BEA)
• Se mantiene en placas Petri o tubos con agar
• Requiere iluminación constante

Medio de cultivo

Macronutrientes: CO₂, H₂O, N (nitrato/amonio), S (sulfato), P (fosfato), Mg, Mn, Ca, Na, K, Cl

Micronutrientes/traza: Fe, Co, Zn, Mo, Cu, B, vitaminas

Importante: Medios de colecciones son para mantenimiento (~2.5 g/L biomasa máx). Para producción industrial se requieren concentraciones mayores calculadas por balances de materia.

Iluminación

• Radiación PAR (400-700 nm) = fotosintéticamente activa
• Medida: PPFD (densidad flujo fotónico fotosintético) en μmol fotones/(m²·s)
• Energía fotón: E = h·ν = hc/λ
• Sol: fuente principal - gratis, distribuida, pero variable y añade calor (50% IR)

Termostatación

• Radiación solar: hasta 1000 W/m², puede calentar 5-10°C/h
• Temperaturas >40°C son letales para la mayoría de cepas
• Solución: cambiadores de calor para mantener T óptima (varía por cepa: 18-38°C)

Agitación/impulsión

Métodos:

• Bombas centrífugas/peristálticas
• Paddle wheels (raceways)
• Airlift (inyección gas)
• Burbujeo (columnas, FBRs verticales)

Funciones: homogeneización, distribución nutrientes, intercambio calor/materia, evitar sedimentación y fouling

Diseño: determinar caudal (q), pérdida presión (ΔP), potencia (Wₘ)

- Referencias

Principal 🔽

• - Richmond, A., & Hu, Q. (Eds.). (2013). Handbook of Microalgal Culture: Applied Phycology and Biotechnology. Wiley-Blackwell.
• - Ras, M., Steyer, J. P., & Bernard, O. (2013). Temperature effect on microalgae: a crucial factor for outdoor production.
• - Borowitzka, M. A., Beardall, J., & Raven, J. A. (Eds.). (2016). The Physiology of Microalgae. Springer.

Datos de cepas 🔽

• - Deniz, I. (2020). Determination of Growth Conditions for Chlorella vulgaris. Marine Science and Technology Bulletin, 9(2), 114-117.
• - Giannelli, L., et al. (2015). Effects of temperature and light on biomass and astaxanthin production by Haematococcus pluvialis. Journal of Applied Phycology, 27, 1-9.
• - Ben-Amotz, A., & Avron, M. (1983). Accumulation of beta-carotene in Dunaliella. Annual Review of Microbiology, 37, 95-119.
• - Sukenik, A. (1991). Ecophysiological considerations in the mass culture of Nannochloropsis. Bioresource Technology, 35(3), 259-269.
• - Martínez, M. E., et al. (1999). Influence of light and temperature on microalgae growth in a continuous culture. Bioresource Technology, 70(2), 161-169.
• - Geider, R. J. (1987). Light and temperature dependence of the carbon to chlorophyll a ratio in microalgae. New Phytologist, 106(1), 1-34.
• - Vonshak, A. (Ed.). (1997). Spirulina platensis (Arthrospira): Physiology, Cell-biology and Biotechnology. Taylor & Francis.
• - Los, D. A., & Murata, N. (2004). Membrane fluidity and its roles in the perception of environmental signals. Frontiers in Bioscience, 9, 2099-2114.
• - Paerl, H. W., & Huisman, J. (2008). Blooms like it hot. Science, 320(5872), 57-58.
• - Ohmori, M., & Hattori, A. (1971). Effect of temperature on nitrogen fixation and ammonium assimilation in Anabaena cylindrica. Plant and Cell Physiology, 12(6), 961-967.